细胞膜电穿孔及其肿瘤治疗的研究

高电压新技术及应用

细胞膜电穿孔及其肿瘤治疗的研究

姚陈果,孙才新,米󰀁彦,王士彬,熊󰀁兰

󰀁

StudyonElectroporationofCellMembraneandTumorTreatment(重庆大学高电压与电工新技术教育部重点实验室,重庆400044)YaoChenguo,SunCaixin,MiYan,WangShibin,XiongLan(HighVoltageandElectricianMajorLaboratoryofEducationMinistry,

ChongqingUniversity,Chongqing400044)

摘󰀁要󰀁电穿孔是在脉冲电场作用下细胞膜暂时出现微孔的物理过程,其结果是细胞内外分子交换显著增加,有利于细胞吸收各种药物、基因物质、蛋白质和其它大分子等。电场取消后微孔关闭而不会对细胞造成任何影响。电穿孔对于研究脉冲电场作用下细胞的结构和功能有重大意义,这种瞬时可逆的膜渗透性增强大大促进了化疗药物的跨膜运送,有效地提高了其杀伤力,为肿瘤的综合治疗提供了一种新思路。

Abstract󰀁Electroporationisaphysicalprocessinducingtran󰀁sientboresincellmembranesbytheapplicationofpulsedelec󰀁tricfields.Thereisasignificantincreaseintheexchangeofmoleculesbetweenthecellinteriorandexterior.Thetransient,reversiblenatureofthiselectricalpermeabilizationofmembranesfacilitatesthecellularuptakeofvariousdrugs,geneticmaterial,proteins,othermicroandmacromolecules.Whentheelectricfieldsarecancelled,theboreswillbeclosed.Itisimportantthatelectroporationisemployedasaresearchtooltostudythecellstructureandfunctionunderpulsedelectricfields.Thein󰀁creasingpermeabilityofcellmembranepromoteshigheruptakeofchemotherapeuticdrugandenhancedkillingofthecancercells.Electroporationprovidesanewmethodfortumortreat󰀁mentundoubtedly.

关键词󰀁电穿孔󰀁细胞膜󰀁肿瘤治疗󰀁不可逆性电击穿Keywords󰀁electroporation󰀁cellmembrane󰀁tumortreatment󰀁irreversibleelectricalbreakdown

中图分类号󰀁Q64󰀁󰀁󰀁文献标识码󰀁A

细胞死亡或减少[1]。NeumannE等证明合理控制脉冲电场能暂时、可逆性地解决细胞膜渗透性障碍[24]。WeaverJC等[5]发现细胞膜在正常生理机能状况下能较好地阻碍离子和亲水分子的传输(如通常细胞膜对Na+和K+的电导率Gm󰀂10S/m2);但受到增大的脉冲电场(强度1kV/cm、持续时间󰀁sms级)刺激而使施加在细胞膜上的跨膜电位超过膜的绝缘强度时,电导率Gm将激增,能在ms时间内达1S/cm2,导致细胞膜阻碍微粒渗透的能力降低。这种由脉冲电场产生的细胞膜渗透性被解释为细胞膜瞬时通透性结构的变化或微孔的形成。

细胞膜电穿孔的结果是细胞内外分子交换显著增加。细胞膜渗透程度[6,7]取决于各种电气、物理、化学和生物电参数(包括脉冲电场强度和持续时间、细胞的尺寸大小和细胞膜两侧的生物化学特性等)。这种暂时可逆的细胞膜渗透性增强为提高细胞对外界粒子的吸收率提供了一种新方法。

对脉冲电场作用下细胞跨膜电压󰀂 m变化的机理,KotnikT等指出:对于任意形状的单细胞,外电场诱导的󰀂 m为:

󰀂 m=f R E(t) cos!(1-e

-t/∀

[11]

[810]

),

0󰀁引󰀁言

WeaverJC等发现给细胞施加脉冲电场将导致细胞膜出现微孔和渗透性,电场取消后微孔大多会关闭而不对细胞造成任何影响,该现象称之为电穿孔(electroporation)即可逆性电击穿(REB)。Hof󰀁mannGA等据此提出了肿瘤的电穿孔疗法(EPT)即采用脉冲电场辅助化疗药物如博莱酶素(BLM)等治疗肿瘤,开创了肿瘤EPT的全新研究领域。1󰀁细胞膜电穿孔

Sale和Hamilton1967年首次提出电场会导致

󰀁国家自然科学基金资助项目(50077027)其中,f是细胞的形状系数,R是细胞半径,E(t)是外加电场强度,!是膜上任意一点到细胞中心与电场的夹角,∀是膜的充电时间常数。细胞两极在外加电场作用下很快达到最大膜电压,细胞膜受电场应力作用而变薄,达到某一临界状态时被击穿而产生电穿孔,其渗透性大大增强,有利于细胞吸收各种药物、基因物质、蛋白质、其它大分子和脂质体等。

目前对细胞膜电穿孔效率即渗透性强弱之影响因素的研究集中在脉冲的场强、脉宽、波形和个数等参数上,最重要的是场强和脉宽。若外加电压诱导的󰀂 m>(0󰀂71)V,细胞膜就发生电穿孔,形成亲

46󰀁 󰀁󰀁Jan.2004󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁HIGH󰀁VOLTAGE󰀁ENGINEERING󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Vol.30No.1水性孔洞,增强渗透性,加剧细胞内外的分子交换。场强较高或脉宽较长有利于增强细胞膜的渗透性,但二者过大将使细胞出现不可恢复的破裂而导致死亡。同时若脉宽太短(使细胞膜充电时间不够)或场强过低,󰀂 m均无法达到击穿阈值。当然,运送的分子类型不同,电穿孔的参数选择也不同[12]。如对于将化疗药物注入肿瘤细胞,典型的场强为1kV/cm、脉宽为100󰀁s;对于基因电转染,场强一般较低(>50V/cm)、脉宽较长(20ms)。细胞膜电穿孔技术已广泛应用于生物医学工程领域(如肿瘤的EPT、经皮给药和基因疗法等[1315])。2󰀁肿瘤的电穿孔疗法及其应用

2.1󰀁电穿孔疗法(EPT)

肿瘤传统疗法虽有多种(包括手术、放疗、化疗、热疗和超声聚焦等),但受其适应症、禁忌症和副作用等限制,疗效不理想。脉冲功率技术的发展及其在医学领域的应用使EPT迅速发展,成为癌症综合治疗的有效手段之一。

通常细胞膜对粒子的通透性较弱,难以大量扩散通过亲水性大分子化疗药物,此缺陷影响了化疗药物的临床应用效果。而EPT[16]采用脉冲电场辅助化疗药物如博莱酶素(BLM)、顺铂(cisplatin)等治疗肿瘤。其治瘤机理是当高强度的脉冲电场(场强高达kV/cm,持续时间为󰀁sms级)施加于肿瘤细胞时,细胞膜会发生电击穿和构形变化,出现大量微孔,使其电导率与粒子通透能力激增,从而促进化疗药物的运送,提高其渗入肿瘤细胞的数量,大大增强药物毒性和杀伤力。

EPT的优点是使用的药物剂量较少,对人体的副作用降到最小,适于那些不能手术切除或靠近关键器官或传统疗法无效的肿瘤治疗。2.2󰀁电穿孔肿瘤治疗仪

电穿孔肿瘤治疗仪以美国Genetronics公司(正在对头颈癌、胰腺癌和肝癌患者作第!期临床试验研究)的MedPulser系统最著名。它由电脉冲发生器(产生固定电压和周期的方波电脉冲)和经消毒处理的针电极阵列组成。其治疗步骤为:#向肿瘤组织注射BLM:∃10min后插入针电极阵列并启动该系统,它将自动在针电极对之间产生旋转脉冲电场。电极针的数目、长度、探头的直径和角度等都可根据临床需要来选择。

仪器备有针对特定肿瘤尺寸的最佳电极阵列,其间嵌有仪器唯一的传感元件,它能自动设置最佳的脉冲电场参数。治疗前系统将对治疗的电气参数进行自检。治疗过程的图像资料将实时提供给医生以确定治疗效果。MedPulser在每对电极间产生R∀

R∀

的电压和脉冲周期都经过了严格的理论电场计算和实验研究,并与使用的电极探头相对应,即每一种电

极探头只能产生与之对应的电脉冲波形。2.3󰀁电穿孔疗法治疗肿瘤的应用

1987年Okino[17]首次用EPT结合化疗药物治疗肿瘤。先给皮下移植有AH-109AY肝癌细胞的Donryu小鼠注射4mg/kgBLM药剂,30min后再给予脉冲电场治疗,试验发现:抗癌效应与脉冲电压(峰值15kV)平方成正比;与脉冲持续时间(2.55.8ms)成正比。且在保持能量不变而改变电压峰值或持续时间时抗癌效应相同。

法国Gustave󰀁Roussy研究所的MichelBelehradek等人采用EPT对头颈部鳞癌作了%/!期临床试验[18]。8名患者平均55岁,共40个肿瘤结节。对每个结节局部注射BLM药物10mg/cm2,3󰀂5min后施以脉宽100󰀁s、场强1󰀂3kV/cm、频率1Hz的脉冲刺激4或8次。试验结果表明,250d观察期内结节57%完全消失,15%缩小一半。试验中治疗12h后治疗区域有红斑和轻度水肿,但24h内即消失,第2天结节呈白色坏死状,几天后形成结痂。曾有两病人皮肤瘙痒和疼痛,两病人皮肤溃疡,但均很快就自行消失,未发生任何意外,且治疗前后的血象检查也表明所有患者无全身性毒副作用。

Genetronics公司局部治疗皮肤癌治愈率达89%,在此基础上,又在美国芝加哥Rush󰀁Presbyte󰀁rian󰀁St.Luke&s医疗中心WilliamPanje博士的配合下开始了头颈癌治疗的%/!期临床研究[19]。6男4女10位患者(3795岁,平均70󰀂7岁)都患有头颈癌(8例鳞癌,2例腺癌),且采用传统疗法效果都不明显。对病人瘤内注射BLM后接着对肿瘤部位施加电脉冲。所用设备为T󰀁820型MedPulser脉冲发生器和六针电极阵列,产生6个脉宽99󰀁s、场强7251100V/cm的方波脉冲。

治疗结果表明,8位鳞癌患者中4位完全治愈(CR),2位部分治愈(PR),2位效果不明显(NR);2位腺癌患者中1位CR,1位PR。综合起来,10患者中5位(50%)CR,3位(30%)PR,2位(20%)NR。可见传统疗法效果不明显时,EPT的疗效令人鼓舞,且未引起任何明显的局部或全身副作用。5位CR患者的治疗时间为210个月不等(平均6个月),且治愈后都未复发。

治疗过程中肿瘤部位出现了组织坏死、脱落、焦痂、硬结等现象。当然,电场中肿瘤周围的正常组织也受到影响。但因场强随着距电极的距离增加而迅速降低,故这种影响只是微弱和暂时的,实验研究发现,正常组织因治疗导致的变化(如短时坏死,发炎,皮肤、肌肉、神经和血管组织的纤维化)在56d内可R∀

2004年1月󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁高电压技术󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁第30卷第1期󰀁 󰀁47󰀁 恢复,并无任何后遗症。3󰀁探索肿瘤治疗的新途径

化疗药物虽能抑制癌细胞,但也会损伤机体,其毒性越大,副作用就越强,对患者生活质量的影响也越严重。EPT只起增强化疗药物疗效的作用,既不能直接杀死癌细胞,又不能从根本上避免化疗药物危害患者身体。随着电脉冲剂量的增加,细胞出现不可恢复的破裂而导致死亡,此即不可逆性电击穿(IREB)。其研究相对于REB尚在起步阶段。目前IREB已用于杀灭细菌等微生物的实验研究中,而能否单独施加脉冲电场,直接利用细胞的IREB特性来杀伤肿瘤细胞则在国内外鲜有报道。

KarlH.Schoenbach等[21]发现不用化疗药物,单独使用场强26300kV/cm、脉宽10300ns的脉冲电场可导致肿瘤细胞程序性死亡(凋亡)并有效抑制肿瘤生长。作者在国家自然科学基金资助下开展了上升时间<160ns、场强100V/cm、脉宽2537󰀁s的指数衰减脉冲∋陡脉冲电场对恶性肿瘤细胞IREB的细胞和动物实验研究,发现陡脉冲电场能有效杀伤恶性肿瘤细胞,明显抑制荷瘤BALB/c小鼠恶性肿瘤的生长、增殖。

细胞的IREB特性用于肿瘤治疗目前还处于机理研究和动物实验阶段。从其进展来看,它将来有可能成为治疗肿瘤的一种新的物理疗法。4󰀁结󰀁语

细胞膜电穿孔为研究细胞内外物质交换提供了一种新方法。电穿孔疗法利用在脉冲电场作用下细胞膜渗透性增强使化疗药物能顺利进入肿瘤细胞的特点,提高了化燎药物的杀伤力。研究者们还探索了单独使用脉冲电场促使肿瘤细胞发生不可逆性电击穿而罪终死亡的研究。总之,肿瘤的电穿孔治疗是一项多学科交叉的、综合性的研究课题,这项技术还需在实践中不断探索、完善以造福于人类。

参

考

文

献

[22,23]

[20]

5󰀁WeaverJC.Electroporation:Adramatic,nonthermalelectricfield

phenomenon[C].Proceedingsofthefirstworldcongressforelec󰀁tricityandmagnetisminBiologyandmedicine.LakeBuenaVista,Florida:AcademicPress,1992

6󰀁NandaGS,MishraKP.Studiesonelectroporationofthethermally

andchemicallytreatedhumanerythrocytes[J].BioelectrochemBioenerge,1994,34:129󰀁134

7󰀁WoutersPC,DutreuxN,SmeltJPPM,etal.Effectsofpulsed

electricfieldsoninactivationkineticsoflisteriainnocua[J].ApplEnvironMicrobiol,1999,65(12):5364󰀁5371

8󰀁CemazarM,MiklavcicD,ScancarJ,etal.Increasedplatinumac󰀁

cumulationinSA󰀁1tumourcellsafterinvivoelectrochemotherapy

withcisplatin[J].BritishJournalofCancer,1999,79(9/10):1386󰀁1391

9󰀁YoshikazuTakeuchi,KohjiMiyawaki,SatoshiKami󰀁yabu,etal.

Useofelectroporationtoacceleratetheskinpermeabilityenhancingactionofoleicacid[J].BiolPharmBull,2000,23(7):850󰀁85410󰀁SauerH,PutzV,FischerK,etal.Increaseddoxorubicinuptake

andtoxicityinmulticellulartumourspheroidstreatedwithDCelec󰀁tricalfields[J].BritishJournalofCancer,1999,80(8):1204󰀁1213

11󰀁TadejKotnik,DamijanMiklav(ci(c,Toma(zSlivnih.Timecourse

oftransmembranevoltageinducedbytime󰀁varyingelectricfields-amethodfortheoreticalanalysisanditsapplication[J].Bioelectro󰀁chemistryandBioenergetics,1998,(45):3󰀁16

12󰀁DevSB,RabussaryDP,GeorgWidera,etal.Medicalapplica󰀁tionsofelectroporation[J].IEEETransactiononPlasmaScience,

2000,28(1):206󰀁223

13󰀁DevSB,HofmannGA.Electrochemotherapy󰀁Anovelmethodof

cancertreatment[J].CancerTreatRev,1994,20:105󰀁11514󰀁HofmannGA,DevSB,NandaGS.Electrochemotherapy:Tran󰀁

sitionfromlaboratorytotheclinic[J].IEEEEngMedBiol,1996,15(6):124󰀁132

15󰀁NishiT,YoshizatoK,YamashiroS,etal.Highefficiencyinvivo

genetransferusingintraarterialplasmidDNAinjectionfollowinginvivoelectroporation[J].CancerRes,1996,56:1050󰀁105516󰀁HofmannGA,DevSB,DimmerS,etal.Electroporationthera󰀁

py:anewapproachforthetreatmentofheadandneckcancer[J].IEEEBiomedEng,1999,46(6):752󰀁75917󰀁

OkinoM.

Optimalelectriccondictionsinelectricalimpulse

chemotherapy[J].JapaneseJournalofCnacerResearch,1992,83(10):1095󰀁1101

18󰀁MichelBelehraclek.Electrochemotherapy:anewantitumortreat󰀁

ment[J].Cancer,1993,72(12):3694󰀁3700

19󰀁PanjeWR,HierMP,GarmanGR,etal.Electroporationthera󰀁

pyofheadandneckcancer[J].AnnOtolRhinolLaryngol,1998,107:779󰀁785

20󰀁KekezMM,SavicP,JohnsonBF.Contributiontothebiophysics

oflethaleffectsofelectricfieldonmicroorganisms[J].BiochimicaetBiophysicaActa,1996,79󰀁88

21󰀁BeebeSJ,FoxPM,RecLJ,etal.Nanosecondpulsedelectric

field(nsPEF)effectsoncellsandtissues:apoptosisinductionandtumorgrowthinhibition[J].IEEETransonPlasmaScience,2002,30(1):286󰀁292

22󰀁SunCaixin,YaoChenguo,MiYan,etal.Experimentalstudyon

irreversibleelectricalbreakdownoftumorcellundersteeppulsedelectricfields[C].IEEEconferenceofEMBS&BMES.Houston,Texas,USA,2002:1675󰀁1676

1󰀁SaleAJH,HamiltonWA.Effectsofelectricfieldsonmicroorga󰀁

nizmsIkillingofbacteriaandyeasts[J].BiochimicaetBiophysicalActa,1967,118:781󰀁788

2󰀁NeumannE,RosenheckK.Permeabilitychangesincludedbyelec󰀁

tricalpulseinvesicularmembranes[J].JournalofMembraneBiolo󰀁gy,1972,11:279󰀁290

3󰀁KinositaKJ,TsongTY.Voltageincludesformationandhemolysis

ofhumanerythocytes[J].BiochimicaetBiophysicalActa,1979,471:227󰀁242

4󰀁HofmannGA,EvansG.Electronicgenetic󰀁physicalandbiological

aspectsofcellularelctromanipulation[J].IEEEEngineeringofMed󰀁icalBiology,1986,5(4):6󰀁25

(下转第51页)

2004年1月󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁高电压技术󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁第30卷第1期󰀁 󰀁51󰀁 2)反应器分析的手段

直接决定高能电子产生的是脉冲放电区域电磁场分布和参数,这与反应器(含电极)设计、脉冲电压参数等有关。场是非静态和非均匀的,又有等离子体产生、电晕放电乃至弧光放电等变化,使电磁场理论分析计算非常复杂,但它是放电处理过程研究和反应器优化等一系列工作的基础,有待深入进行。

3)光催化剂的施加

加光催化剂可有效加速原有等离子体反应,但施加方法及光催化剂载体的结构、与电极的关系、乃至光源形态参数,都将影响其效率。

4)反应器结构的创新

线-板或线半筒反应器仍被大量采用,但填充式反应器也崭露头角,新型或结合方式及多级反应器正在涌现。

5)模块化小型轻量化

模块化使生产、维护成本降低,可靠性提高,小型轻量化适用于家居、办公、汽车驾驶室等场合。6)智能化

对大型室内场合(电影院等)需多个等离子体空气净化装置构成净化系统,从而存在对不同方位污染情况的检测及数据处理,及对相应位置等离子体发生单元的控制等问题。用智能控制法将大势所趋,即使单机控制也是一个发展方向。4󰀁结束语

结合光催化、精滤、新材料及智能控制等内容的等离子体室内空气净化技术以其高效、无二次污染、低噪声和装置的轻薄短小化,不仅在居家、宾馆、办公和娱乐场所和汽车、飞机等有限空间内的空气净化中前景无限,甚至在飞船和太空站等空气循环利用方面也展示了其应用潜能。

参

考

文

献

3󰀁StacyL,Daniels.Onthelonizationofairforremovalofnoxiousef󰀁

fluvia[J].IEEETransactionsonPlasmaScience,2002,30(4):1471

4󰀁KimberlyKelly󰀁Wintenberg,DanielM.Sherman,etal.Airfilter

sterilizationusingaoneatmosphereuniformglowdischargeplasma(theVolfilter)[J].IEEETransactionsonPlasmaScience,2000,28(1):64󰀁70

5󰀁J.ReeceRoth.Industrialplasmaengineering/Vol.1:Pinciples

[M].[S.I]IoppublishingLtd,1995

6󰀁LTanasomwang,FCLai.Long-termozonegenerationfromelec󰀁

trostaticaircleaners[C].IEEEIA.SocietyAnnualMeeting.New

Orleans,1997:75󰀁787󰀁MRHoffman,STMartin,etal.Environmentalapplicationsof

semiconductorphotocatalysis[J].ChemicalReviews,1995,95(2):69󰀁96

8󰀁AMills,LSHunte.Anoverviewofsemiconductorphotocatalysis

[J].JPhotochemistryandPhotobiolotyA:Chemistry,1997,108(1):1󰀁35

9󰀁KHofstadler,RBauer,etal.TiO2-assisteddegradationofenvi󰀁

ronmentallyrelevantorganicconpoundsinwastewaterusinganovelfluidizedbedphotoreactor[J].Environ.Sci.&Technol.1996,30(3):817󰀁824

10󰀁NIPeill,MRHoffmann.DevelopmentandoptimizationofaTiO2

-coatedfiber-opticcablereaction:PhotocatalyticDegradationof4-Chllrophenol[J].Environ.Sci.&Technol.1995,29(12):2974󰀁2981

11󰀁AkiraMizuno,YoshiyukiKisanuki,etal.Indooraircleaningusing

apulseddischargeplasma[J].IEEETransonIA,1999,35(6):1284󰀁1288

12󰀁MasaakiOkubo,ToshiakiYamamoto,etal.Electricaircleaner

composedofnonthermalplasmareactorandelectrostaticprecipita󰀁tor[J].IEEETransonIA,2001,37(5):1505󰀁1511

13󰀁AMizuno.Electrostaticprecipitation[J].IEEETransonDilectrics

andElectricalInsulation,2000,7(5):615󰀁624

14󰀁ShigeruFutamura,HisahiroEinaga,etal.Comparisonofreactor

performanceinthenonthermalplasmachemicalprocessingofhaz󰀁ardousairpollutants[J].IEEETransonIA,2001,37(4):978󰀁985

15󰀁MilhailSkliar,RamirezWF.Monitoringanddetectionofindoor

aircontamination[C].Proceedingoftheamericancontrolconfer󰀁encealbuquerque.NewMeixco,1997:319󰀁323

16󰀁ShoomGB,BowenDG.IAQES:anexpertsystemforindoorairqualityproblemresolution[C].IEEESIGAIConferences:AiSys󰀁

temsinGovernment.Washington,1990:127󰀁133

17󰀁BlackMS.Indoorairqualityandofficeequipment[C].Proceed󰀁

1󰀁NSPanikov,SPaduraru,RCrowe,etal.Destructionofbacillus

subtiliscellsusinganatmospheric-pressuredielectriccapillaryelec󰀁trodedischargeplasma[J].IEEETrans.onPlasmaScience,2002,

30(4):1424󰀁14282󰀁KepingYan,HexingHui,etal.Coronainducednon-thermalplas󰀁

mas:FundamentalStudyandIndustrialApplications[J].JournalofElectrostatics,1998,44(1):17󰀁39

究。电话:(0451)86416021

史文祥󰀁1978年生,硕士,从事放电等离子体及应用研究。

ingsoftheIEEEInternationalSymposiumonElectronicsandtheEnvironment.Chicago,1998:75󰀁78

(收稿日期󰀁2003󰀁07󰀁10)

王晓明󰀁1948年生,博士,教授,从事放电技术及应用等方面的研

(上接第47页)

23󰀁SunCaixin,XiongLan,YaoChenguo,etal.Cytocidalandin󰀁

hibitoryeffectofenergy󰀁controllablepulseonovariancancercelllineSKOV3[C].IEEEconferenceofEMBS&BMES.Houston,Texas,USA,2002:703󰀁704

(收稿日期󰀁2003󰀁07󰀁08)

姚陈果󰀁1975年生,博士,讲师,现从事电工新技术在生物医学工程

中应用的研究。电话:(023)65102442󰀁8304

孙才新󰀁1944年生,教授,博导,长期从事电工新技术在生物医学工

程中应用的研究。