(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112430252 A(43)申请公布日 2021.03.02
(21)申请号 202011265249.7(22)申请日 2020.11.13
(71)申请人 宜昌东阳光长江药业股份有限公司
地址 443300 湖北省宜昌市宜都市滨江路
34号(72)发明人 李爽 贾永峰 苏周 刘晔
戴祖冰 (74)专利代理机构 宜昌市慧宜专利商标代理事
务所(特殊普通合伙) 42226
代理人 彭娅(51)Int.Cl.
C07K 1/22(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/20(2006.01)C07K 14/62(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图1页
C12N 9/76(2006.01)
(54)发明名称
一种提高目标蛋白回收率的层析方法(57)摘要
本发明涉及一种提高目标蛋白回收率的层析方法，方法包括：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液，取层析介质装填层析柱，控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。本发明通过在样品中添加盐类，同时调节样品溶液的pH值与温度，改善了目标蛋白与层析介质的结合环境，提高了样品的捕获效率，回收率高达95%以上。
CN 112430252 ACN 112430252 A
权 利 要 求 书
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1.一种提高目标蛋白回收率的层析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；
S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱；S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中目标蛋白为胰岛素或胰岛素类似物或蛋白酶或多肽类。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料或大孔吸附层析填料或离子交换层析填料或反相层析填料。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中盐类为硫酸盐或柠檬酸盐或乙酸盐或其组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硫酸盐为硫酸镁或硫酸钠或硫酸铵，柠檬酸盐为柠檬酸钠，乙酸盐为乙酸钠或乙酸铵。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，盐类加入量为0.05~0.5mol/L。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中调节pH值高于或低于目标蛋白等电点1个单位以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述调节pH值的酸性物质为磷酸或冰乙酸或柠檬酸或盐酸；调节pH值的碱性物质为氢氧化钠或氨水或氢氧化钾。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为25~30℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中：层析过程如下：①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱；②、上样：将处理后的样品上柱；③、冲洗：使用平衡液或冲洗液冲洗；④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；⑤、再生：使用再生液对填料进行再生处理；其中，上样、冲洗与洗脱流速为60~210cm/h。
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说 明 书
一种提高目标蛋白回收率的层析方法
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技术领域
[0001]本发明属于生物制药技术领域，涉及一种提高目标蛋白回收率的层析方法。背景技术
[0002]蛋白药物是生物制药领域的重要发展方向之一，研究或制备蛋白药物需要一种合适的蛋白分离纯化技术从含有目标蛋白的溶液中回收目标蛋白。蛋白分离纯化是利用不同蛋白间内在的相似性与差异性来除去蛋白和非蛋白物质杂质。基于吸附机理的层析技术是最常用的蛋白质分离纯化方法之一。
[0003]吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的吸附、脱附作用而实现分离的一种纯化技术。其吸附的作用力通常包括：被分离样品与层析介质之间相反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶极分子之间定向力及范德华力等。常见的层析介质有亲和填料、离子交换填料、吸附树脂填料等。层析介质(或层析填料)与蛋白之间的吸附性能决定了分离纯化的效果。吸附性能除了受样品与层析介质之间作用机理的影响，还受蛋白性质或状态以及溶液性质的影响。
[0004]目前对于蛋白分离纯化的研究主要包括两方面：一是层析介质的制备与改性研究：如CN101415692B、CN201310168576、CN101827648A制备了不同的蛋白质分离纯化层析介质；卢慧丽(层析介质孔径与配基密度对蛋白吸附性能影响及抗体分离[D]，浙江大学，2014年)、苑俊敏(三种基于接枝聚合物链的吸附分离材料的制备和应用[D]，西北大学，2012年)等研究了层析介质的改性等。这些方法需要开发专用的层析填料与相应的层析工艺，通用性差，且开发工艺复杂、耗时长，同时定制化的层析填料商业风险大。另一方面是对层析工艺过程的改进研究，主要是通过优化缓冲盐导电率或浓度或pH值或改进洗脱方式来分离纯化蛋白质：如CN1260249C及其各分案通过改变缓冲液的导电率和/或pH来分离多肽；CN106496302A通过使用不同pH和/或浓度的Tris缓冲液、采用多步洗脱的方式除去蛋白质中的不同杂质；CN102382168A在蛋白混合物与层析缓冲液中添加适量的蛋白结合金属离子(Fe3+、Ca2+)，以提高目标蛋白与杂蛋白在离子交换层析中的分辨率，该方法只能用于与金属离子具有结合作用的蛋白，其目的是保持目标蛋白的三级结构。上述方法主要目的是去除杂蛋白或提高分辨率，并没有针对目标蛋白的回收率进行优化，因此回收率较低。发明内容
[0005]为解决上述技术问题，提供一种提高目标蛋白回收率的层析方法，通过改善样品环境以提高蛋白与层析介质之间的结合力，使与层析介质结合的氨基酸基团充分暴露出来，增加了蛋白与层析介质的有效接触部位，同时控制样品温度，以提高蛋白与层析介质之间的结合力，从而提高回收率。[0006]本发明的技术方案是：
[0007]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0008]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理
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说 明 书
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后的样品溶液；[0009]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱；[0010]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0011]优选地，所述步骤S1中目标蛋白为胰岛素或胰岛素类似物或蛋白酶或多肽类。[0012]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料或大孔吸附层析或离子交换层析填料或反相层析填料。[0013]优选地，所述步骤S1中盐类为硫酸盐或柠檬酸盐或乙酸盐或其组合。[0014]进一步优选地，所述硫酸盐为硫酸镁或硫酸钠或硫酸铵，柠檬酸盐为柠檬酸钠，乙酸盐为乙酸钠或乙酸铵。[0015]进一步优选地，盐类加入量为0.05～0.5mol/L。[0016]更优选地，盐类加入量为0.1～0.3mol/L。[0017]优选地，所述步骤S1中调节pH值高于或低于目标蛋白等电点1个单位以上。[0018]进一步优选地，所述调节pH值的酸性物质为磷酸或冰乙酸或柠檬酸或盐酸；调节pH值的碱性物质为氢氧化钠或氨水或氢氧化钾。[0019]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为25～30℃。[0020]优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0021]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱；[0022]②、上样：将处理后的样品上柱；[0023]③、冲洗：使用平衡液或冲洗液冲洗；[0024]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0025]⑤、再生：使用再生液对填料进行再生处理。[0026]其中，上样、冲洗与洗脱流速为60～210cm/h。[0027]本发明有益效果：[0028](1)本发明通过在样品中添加盐类，调节样品溶液的pH值，使与层析介质结合的氨基酸基团充分暴露出来，增加了蛋白与层析介质的有效接触部位，同时控制样品温度，以提高蛋白与层析介质之间的结合力。通过上述调控，极大提高了样品的捕获效率，回收率高达95％以上。[0029](2)本发明改善了蛋白与层析介质之间的结合力，从而可使上样、洗脱等步骤的流速大幅度提高而不减低回收率。上样、冲洗与洗脱流速一般在135cm/h以下，添加盐类后可提高至150～210cm/h，从而缩短工时40％以上，大幅度提高了生产效率。[0030](3)本发明基于提高蛋白与层析介质之间的结合力，因此可应用于层析机理相同、性质类似的其它层析介质，适应性强。不需改变原有层析介质与层析工艺，仅做简单的样品处理即可提高回收率，操作简单，实施成本低，易于商业化与规模化应用。附图说明
[0031]图1为是本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
[0032]本发明将通过以下实施例作进一步说明。实施例仅用于说明本发明而不限制本发
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明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记录内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中，文中所述的较佳实施方法仅作示范之用。[0033]本发明方法中，采用层析系统为美国通用电气公司的AKTAavant25系统，层析柱为XK16玻璃柱，检测器检测波长280nm；物料与试剂采用分析纯。样品采用Waterse2695高效液相色谱仪检测目标蛋白浓度。
[0034][0035]
回收率计算方法：
实施例1
[0036]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0037]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0038]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度28cm；[0039]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0040]所述步骤S1中目标蛋白为甘精胰岛素前体。[0041]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料。[0042]优选地，所述步骤S1中盐类为不同浓度的硫酸镁。[0043]优选地，所述步骤S1中调节pH值为4.8，调节用碱为4mol/L的氢氧化钠溶液。[0044]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为27℃。[0045]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0046]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV(CV即柱体积，Columnvolume)；[0047]②、上样：将处理后的样品上柱；[0048]③、冲洗：使用冲洗液冲洗3.5CV；[0049]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0050]⑤、再生：使用再生液再生填料3CV；[0051]上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。[0052]本实施例结果见表1，通过在样品中加入不同浓度的硫酸镁，改善了蛋白与层析介质之间的结合，当硫酸镁用量在0.1～0.3mol/L时，目标蛋白回收率达到了95.0％以上，最高时达到了98.5％。但当硫酸镁浓度过高时会抑制蛋白在层析介质上的结合，导致回收率下降。
[0053]表1实施例1数据
[0054]
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实施例2
[0056]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0057]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0058]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度28cm；[0059]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0060]所述步骤S1中目标蛋白为甘精胰岛素前体。[0061]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料。[0062]优选地，所述步骤S1中盐类为硫酸镁，加入量为0.15mol/L。[0063]优选地，所述步骤S1中调节pH值为4.8，调节用碱为4mol/L的氢氧化钠溶液。[0064]优选地，所述步骤S3中：样品溶液控制不同的上样温度。[0065]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0066]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV；[0067]②、上样：将处理后的样品上柱；[0068]③、冲洗：使用冲洗液冲洗3.5CV；[0069]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0070]⑤、再生：使用再生液再生填料3CV；[0071]上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。[0072]本实施例结果见表2，不同的样品温度对蛋白与层析介质之间的结合力影响不同。随着样品温度的层高，结合力增强，目标蛋白回收率增加。当样品温度在27℃以上时，目标蛋白回收率高达98％以上。[0073]表2实施例2数据
[0074]
实施例3
[0076]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0077]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0078]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度28cm；[0079]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0080]所述步骤S1中目标蛋白为甘精胰岛素前体。[0081]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料。[0082]优选地，所述步骤S1中盐类为硫酸镁，加入量为0.15mol/L。[0083]优选地，所述步骤S1中调节样品溶液不同的pH值。[0084]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为27℃。
[0075]
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进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：
[0086]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV；[0087]②、上样：将处理后的样品上柱；[0088]③、冲洗：使用冲洗液冲洗3.5CV；[0089]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0090]⑤、再生：使用再生液再生填料3CV；[0091]上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。
[0092]由于层析操作过程中需要保证样品能溶解于流动相，因此pH值需避开蛋白的等电点。本实施例针对甘精胰岛素前体(PI为6.9)考察了不同pH值对吸附特性的影响，由表3可知，pH值在4.5～5.0之间时层析过程回收率相差不大，均在95％以上。[0093]表3实施例3数据
[0094]
实施例4
[0096]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0097]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0098]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度28cm；[0099]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0100]所述步骤S1中目标蛋白为甘精胰岛素前体。[0101]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料。[0102]优选地，所述步骤S1中盐类为不同盐类。[0103]优选地，所述步骤S1中调节pH值为4.8。[0104]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为27℃。[0105]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0106]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV；[0107]②、上样：将处理后的样品上柱；[0108]③、冲洗：使用冲洗液冲洗3.5CV；[0109]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0110]⑤、再生：使用再生液再生填料3CV；[0111]上样、冲洗与洗脱流速为90～210cm/h。[0112]本实施例结果见表4，当样品中添加硫酸盐或柠檬酸盐或乙酸盐等不同盐类或其复合物后，均有利于提高目标蛋白回收率，回收率在95％左右。主要是因为添加盐类后，使蛋白中与层析介质结合的氨基酸基团暴露出来，增加了蛋白与层析介质的有效接触部位，提高了蛋白与层析介质之间的结合能力，使得回收率提高。但当加入磷酸盐等盐类时，这些
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氨基酸基团被折叠到了内部，导致上样时蛋白不能有效结合到层析介质上，回收率大幅度下降。
[0113]而当不添加任何盐类时，目标蛋白与层析介质之间结合力也较弱，回收率较低，即使采取降低流速等措施，回收率提高也有限。[0114]因此，样品中添加硫酸盐或柠檬酸盐或乙酸盐等可提高回收率，同时在保证回收率的情况下，可通过提高流速缩短工时，提高生产效率。[0115]表4实施例4数据
[0116]
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实施例5
[0119]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0120]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0121]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度28cm；[0122]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0123]所述步骤S1中目标蛋白为门冬胰岛素前体。[0124]优选地，所述步骤S2中层析介质为亲和层析填料。[0125]优选地，所述步骤S1中加入不同的盐类，加入量为0.1～0.3mol/L。[0126]优选地，所述步骤S1中调节pH值为5.5。[0127]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为25～30℃。[0128]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0129]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱4CV；[0130]②、上样：将处理后的样品上柱；[0131]③、冲洗：使用平衡液冲洗5CV；[0132]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0133]⑤、再生：使用再生液再生填料3CV；
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上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。
[0135]本实施例采用门冬胰岛素前体作为目标蛋白，亲和层析填料进行层析，实施例结果见表5。当样品中添加硫酸镁等盐类后回收率高达95％以上。[0136]表5实施例5数据
[0137]
实施例6
[0139]一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：[0140]S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理后的样品溶液；[0141]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度18cm；[0142]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0143]所述步骤S1中目标蛋白为重组胰蛋白酶。[0144]优选地，所述步骤S2中层析介质为阳离子交换层析填料。[0145]优选地，所述步骤S1中加入不同盐类，加入量为0.1～0.3mol/L。[0146]优选地，所述步骤S1中调节pH值为5.3。[0147]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为25～30℃。[0148]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0149]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV；[0150]②、上样：将处理后的样品上柱；[0151]③、冲洗：使用平衡液冲洗2CV；[0152]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0153]⑤、再生：使用再生液再生填料3.5CV；[0154]上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。
[0155]本实施例采用重组胰蛋白酶作为目标蛋白，以阳离子层析交换填料进行层析，实施例结果见表6。可以看出，目标蛋白回收率也高达95％。[0156]表6实施例6数据
[0157]
[0138]
[0158][0159][0160]
实施例7
一种提高目标蛋白回收率的层析方法，所述方法包括以下步骤：
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S1：样品溶液处理：以含有目标蛋白的溶液为原料，加入盐类，调节pH值，得到处理
后的样品溶液；[0162]S2：进行吸附层析：取层析介质装填层析柱，装填高度100cm；[0163]S3：控制处理后的样品溶液上样温度，进行层析操作。[0164]所述步骤S1中目标蛋白为重组人胰岛素前体。[0165]优选地，所述步骤S2中层析介质为大孔吸附树脂填料。[0166]优选地，所述步骤S1中加入不同盐类，加入量为0.1～0.3mol/L。[0167]优选地，所述步骤S1中调节pH值为4.5。[0168]优选地，所述步骤S3中：样品溶液上样温度为25～30℃。[0169]进一步优选地，所述步骤S3中：层析过程如下：[0170]①、平衡：使用平衡液冲洗层析柱3CV；[0171]②、上样：将处理后的样品上柱；[0172]③、冲洗：使用平衡液冲洗3CV；[0173]④、洗脱：使用洗脱液洗脱，同时对主峰进行收集；[0174]⑤、再生：使用再生液再生填料3.5CV；[0175]上样、冲洗与洗脱流速为210cm/h。
[0176]本实施例采用重组人胰岛素前体作为目标蛋白，以大孔吸附树脂填料进行层析，实施例结果见表7。可以看出，目标蛋白回收率也高达95％。[0177]表7实施例7数据
[0178]
[0179]
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的
精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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说 明 书 附 图
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图1
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